Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой структурой является белковый ядерный остов или матрикс . Необходимо сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра, которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще «ядерным скелетом».

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка, связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие «ершика для чистки бутылок» (см. рис. 67).

Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные липопротеидные мембраны.

Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. табл. 6).

Таблица 6 . Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения ядерного белкового матрикса

Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-HCI буфера и 5 мМ MgCI 2 помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2 М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков. Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1% фосфолипидов.

Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у различных объектов (см. табл. 7).

Таблица 7 . Состав ядерного белкового матрикса

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный) слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (рис. 68).

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL – “pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер. Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью, располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой сети входят различные гранулы РНП-природы.

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко – плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из плотно уложенных фибрилл.

Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса, так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.

Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные ядрышки.

Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты, обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены отчетливо.

Как было видно из табл. 7, основной компонент остаточных структур ядра – белок, содержание которого может колебаться от 98 до 88%. Белковый состав ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов . Кроме этих основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.

Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым), входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также препараты ядерного матрикса содержат значительные количества промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра даже после удаления ядерных мембран.

В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают внутреннюю мембрану ядерной оболочки, могут разбираться при фосфорилировании ламинов, и вновь полимеризоваться при их дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и всей ядерной оболочки.

Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или «скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за поддержание петлевой организации ДНК.

Ядрышки – плотные, интенсивно окрашенные округлые образования в ядре размером 1-2 мкм. Их может быть несколько. Ядрышки образуются в ядре в области ядрышковых организаторов, которые обычно располагаются в области вторичных перетяжек некоторых хромосом. Там находятся гены, кодирующие рибосомную РНК. Ядрышки состоят из гранулярного и фибрилярного компонентов. Гранулы ядрышек представляют собой субъединицы рибосом, а нити – молекулы образовавшейся рибосомной РНК. Последние связываются с белками, поступающими из цитоплазмы, с образованием субъединиц рибосом. Эти субъединицы через ядерные поры выходят в цитоплазму, где объединяются в рибосомы и связываются с информационной РНК для синтеза белка. Чем выше функциональная, синтетическая активность клетки, тем многочисленней и крупнее её ядрышки.

Транскрипция нерибосомных генов.

Ядерный белковый матрикс.

Кариоплазма (ядерный сок) – жидкий компонент ядра, истинный раствор биополимеров, в котором во взвешенном состоянии расположены хромосомы и ядрышко. По своим физико-химическим свойствам кариоплазма близка к гиалоплазме.

Ядерная оболочка.

Ядерная оболочка отделяет ядро от цитоплазмы, отграничивает его содержимое и обеспечивает обмен веществ между ядром и цитоплазмой. Ядерная оболочка состоит из двух биологических мембран , между которыми расположено перинуклеарное пространство шириной 15-40 нм. Наружная мембрана ядра покрыта рибосомами и переходит в мембраны гранулярной эндоплазматической сети. К внутренней мембране прилежит слой белковых филаментов (ламина ) кариоскелета, через который к ядерной оболочке прикрепляются хромосомы (рис. 2-9).

В ядерной оболочке имеются отверстия – ядерные поры диаметром 90 нм (рис. 2-10). Они являются не просто отверстиями, а очень сложно организованными комплексами пор. В их состав входят белки, которые образуют по краю поры три ряда по 8 гранул, а в центре поры расположена 1 гранула, связанная белковыми нитями с периферическими гранулами.

При этом образуется перегородка, диафрагма толщиной 5 нм. Эти комплексы пор обладают избирательной проницаемостью: через них не могут пройти мелкие ионы, но переносятся длинные нити информационной РНК и субъединицы рибосом.

В ядре имеется несколько тысяч пор, занимающих от 3 до 35% его поверхности. Количество их значительно больше в клетках с интенсивными синтетическими и обменными процессами. В ядерных оболочках зрелых сперматозоидов, где биосинтез белка не происходит, поры не обнаружены. Замечено также, что чем выше функциональная активность клетки, тем сильнее извита кариолемма (для увеличения площади обмена веществ между ядром и цитоплазмой).

Общий состав ядерного матрикса

Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые

хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая

организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только

для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление

от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов

репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для

осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная

внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для

всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой

структурой является белковый ядерный остов или матрикс . Необходимо

сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой

морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический

гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков

хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра,

которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической

структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще

«ядерным скелетом».

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были

выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при

последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором

NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а

основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка,

связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок

и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в

нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие

«ершика для чистки бутылок» (см.

Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и

привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках

ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был

предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур

ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций

ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование

неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные

липопротеидные мембраны.

Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению

препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. т

Таблица 6

. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения

ядерного белкового матрикса

Обработка

Фосфолипи

1.Изолированны

2. 0,2 мМ MgCl

4. 1% Тритон Х-

5.ДНКаза+РНКа

Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-

HCI буфера и 5 мМ MgCI

помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где

деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2

М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и

ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков.

Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к

полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного

матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно

растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную

фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из

негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1%

фосфолипидов.

Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у

различных объектов (см.

Таблица 7

Фосфолипи

Крыса, печень 97 0,1 1,2

Клетки HeLa

Тетрахимена 97 0,1

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней

мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный)

слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или

интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий

внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы

ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть

ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL –

“pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью

морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой

периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде

относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между

внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный

белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать

морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной

оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер.

Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае

перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после

экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью,

располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой

сети входят различные гранулы РНП-природы.

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко –

плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из

плотно уложенных фибрилл.

Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса,

так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки

ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в

относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.

Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса

большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра

предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию

S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс

представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат

натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен

всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных

гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные

Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса

представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты,

обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в

зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей

нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном

репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в

этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В

эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют

транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены

отчетливо.

Как было видно из

7, основной компонент остаточных структур ядра –

ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него

являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов . Кроме этих

основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество

минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.

Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины

A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин

B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он

более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с

мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при

разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу

промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым),

входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также

препараты

ядерного

матрикса

значительные

количества

промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра

даже после удаления ядерных мембран.

В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не

образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом

укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают

внутреннюю мембрану ядерной

оболочки, могут разбираться при

фосфорилировании

ламинов, и

полимеризоваться

дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и

всей ядерной оболочки.

Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще

не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих

участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании

розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о

том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины

розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что

полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков

ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или

«скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за

поддержание петлевой организации ДНК.

ДНК ядерного белкового матрикса

Рассматривая особенности ДНК, входящей в состав ядерного матрикса,

необходимо еще раз подчеркнуть, что эта остаточная ДНК представлена в

минимальном количестве (0,1-1% от сухого веса фракции) составляет лишь

менее 1% от всей ДНК ядра. Эта ДНК оказалась устойчивой к действию

нуклеаз, вероятно за счет ее существования в виде прочных ДНК-белковых

комплексов.

Большой интерес представляет изучение фрагментов ДНК, входящих в состав

ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах существует от 60000 до

125000 участков ДНК, защищенных от действия нуклеаз и эти участки могут

быть расположены на всех трех компонентах ядерного матркса.

Подробно изучена ДНК ядерного матрикса клеток асцитной карциномы

Эрлиха мышей. Так были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК

в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные

фрагменты размером около 10 т.п.н., они составляли всего 0,02% от исходного

количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор

хромосом, т.е. всего2-3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на

хромосому. Эти фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и были связаны

с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в

обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью

закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.

Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших

участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они

встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.н., представляющих

собой, вероятно петли основной массы хроматина (

69). Функциональное

значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том,

что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных

структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при

его активации.

Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено,

что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR – matrix attachment

regions или SAR – scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н.

и располагаются друг от друга на расстоянии 5-112 т.п.н. У дрозофилы на ядро

приходится по крайней мере 10 000 таких MAR (или SAR) областей.

Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или

даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомеразой II, которая играет

основную структурную и ферментативную роль в образовании петель

хроматина. Более того один из белков матрикса («скэффолда») митотических

хромосом, белок Scl оказался просто топоизомеразой II. С помощью

иммунофлуоресценции было показано, что на интерфазных хромосомах Scl

локализуется в основании петель ДНК.

При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами

было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК. Было

обнаружено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку,

связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано

в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание

репликация ДНК. Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом,

оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса

обнаружена ДНК-полимераза

a, основной фермент репликации ДНК. Кроме

него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного

комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II.

Высказана гипотеза о том, что репликация ДНК осуществляется таким образом,

что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе

репликационные комплексы (

70). Было обнаружено, что участки начала

репликации ДНК располагаются вблизи (или совпадают с ними) участков

постоянного прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, включающей в себя как

гетерогенную высокомолекулярную РНК, так и рибосомную РНК, и РНК

ядерных малых РНП. На возможность связи элементов матрикса с процессами

транскрипции указывали данные о том, что при коротком мечении матрикс

обогащался быстро меченной гетерогенной РНК. Было обнаружено, что в

состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II,

ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом клеток

яйцеводов кур оказалась связанной большая часть (95%) новосинтезированных

пре-мРНК овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к заключению,

что ядерный матрикс может выполнять структурную роль в синтезе,

процессинге и транспорте РНК в ядре.

С ядерным матриксом связаны собственно транскрибирующиеся гены.

Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама

транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричной ДНК

относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-

полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного

белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мя

РНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе

сплайсинга (см. ниже). Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые

сплайсосомами , собраны в группы или кластеры, связанные с белками

ядерного матрикса.

Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции

транскрипции. Так участки MAR обычно связаны с такими регуляторными

последовательностями на ДНК как энхансеры и сайленсеры, определяющими

интенсивность

транскрипционных

процессов. На

матриксе

локализованы белки-рецепторы для ряда стероидных гормонов.

Относительно связи ДНК с элементами ядерного матикса на сегодня

сложились представления о том, что эта связь может отражать различные

функциональные особенности. Так связь ДНК с ламиной может отражать

структурную, постоянную ассоциацию ДНК, а связь с внутренними элементами

– функциональную, связанную как с синтезом ДНК, так и РНК,

Поведение белков ядерного матрикса во время митоза изучено еще далеко

недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ее компоненты

разбираются, частично переходя в цитоплазму, частично (ламин В) оставаясь в

связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса

сведений меньше: известно, что часть этих белков входит в состав матрикса

(«скэффолда») митотических хромосом.

Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина

Исследуя структурную организацию хроматина и хромосом можно

определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ДНК. Первый –

нуклеосомный, дающий 7-кратное уплотнение ДНК в составе фибрилл ДНП,

второй – 30 н.м. фибрилла или нуклеомерный уровень с40--70-кратной

степенью упаковки, третий – доменно-петлевой или хромомерный приводящий

к 600-700-кратному уплотнению ДНК в составе этих структур. Для

поддержания первых двух уровней компактизации было достаточно участие

только гистоновых белков, тогда как петлевые и розетко-подобные доменные

структуры уже требовали участия негистоновых белков, и перехода от

спирального или соленоидного типа укладки ДНК к образованию компактных

глобулярных структур, состоящих из петель хроматиновых 30-нм фибрилл, к

структурам типа хромомеров , имеющих уже размеры 0,1-0,2 мкм.

Однако еще в классических работах цитологов начала ХХ века как в

интерфазных ядрах, так и, особенно, в митотических хромосомах описывались

нитчатые структуры – хромонемы , имеющие толщину 0,1-0,2 мкм. Их

удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках.

Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных

этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердило

наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (

При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромсом

необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина.

Хромонему – нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0,1-0,2

мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной

конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в

телофазе. Причем такие хромонемы выявляются как в клетках растений, так и

животных (

Изучение профазных хромосом как животных, так и растений показывает, что

процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный

этап – образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур,

являющихся единицей последующей хромосомной структуризации.

В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные

элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации

митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно

видеть признаки хромонемной организации хромосом. В поздней анафазе, когда

хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова

выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной 0,2 мкм. При

этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей

деконденсации митотических хромосом. Эта начальная стадия деконденсации

связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением,

обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и

выраженным этот процесс становится в телофазе. В это время хромосомы

начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными

участками хромонемы также возрастает. В расположении отдельных нитей

хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются признаки

спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые

участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность

хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев

при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических

хромосом (

74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены

ядерной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся на значительные

расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время

некоторые участки хромонем начинают разрыхляться, их толщина взрастает.

Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением

хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть

картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за

счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их

разрыхления, деконденсации самих хромонем.

Ультраструктурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП

хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении

хромосом при понижении концентрации двухвалентных катионов. Оказалось,

что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется так, что

выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы

представлены сечениями толстых (0,1-0,2 мкм) хромосомных нитей, хромонем

73). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных

катионов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество

линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром около

0,1-0,2 мкм. В

дальнейшем

блоки (хромомеры) начинают

деконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре

остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Важно

отметить, что расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с

рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей деконденсации

петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомеров прогрессивно

уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на

срезах равномерно расположенным фибриллами ДНП.

Надо отметить, что в современных молекулярно биологических

исследованиях строения хромосом хромонемный уровень, как один из высших

уровней упаковки ДНП, совершенно выпадает из поля зрения исследователей.

Лишь в последнее время некоторые исследователи на основании косвенных

данных приходят к выводам о наличии в интерфазных ядрах хромонемо-

подобных структур.

Ядерный скелет (ядерный матрикс)

Ультраструктура. Ядерный скелет представляет собой следующую систему:

• плотная пластинка (ламина) с норовыми комплексами;
• фибриллярно-гранулярная сеть.

В состав скелета входят негис- тоновыс белки (в том числе актин и миозин), факторы транскрипции, полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты.

Функции. Ядерный скелет выполняет следующие функции:

• поддерживает форму ядра;
• является опорой для хроматиновых структур (в частности, с помощью ядерного скелета хромосомы внутри ядра занимают совершенно определенные нсперекрывающисся области - хромосомные территории; при этом хромосомы, содержащие большое число генов, локализуются ближе к центру ядра);
• обеспечивает внутриядерный транспорт частиц и веществ;
• участвует в регуляции транскрипции.

Биогенез. Формируется в телофазе из растворенных белков.

Ядрышко

Строение. Округлое компактное образование преимущественно нитчатого строения. Структурные компоненты:

• нуклеолонема (основная нитчатая структура, состоит из рибо- ][уклеопротеид] iых нитей);
• гранулярный компонент (рибонуклеопротеидные гранулы);
• ядрышковый хроматин.

Биохимическая характеристика. В состав ядрышка входят следующие компоненты:

• ДНК (в форме дезоксирибонуклеопротеида) содержит гены, кодирующие pPIIK;
• ферменты транскрипции;
• рРНК;
• рибонуклеопротеиды (фибриллы и гранулы - рибосомы на разных стадиях созревания);
• негистоновые белки;
• минеральные компоненты.

Функции. Ядрышко выполняет следующие функции:

• биосинтез РНК;
• сборку рибосомиых частиц (белки приходят из цитоплазмы).

Биогенез. Формируется в телофазе при участии ядрышкового

организатора - специального участка определенной хромососы (подробнее см. морфологическую классификацию хромосом на с. 84).

Хроматиновые структуры

Хроматин и хромосомы - две формы существования одного материала: в ядрах неделящихся клеток - хроматин, в делящихся митозом или мейозом - хромосомы.

Биохимическая характеристика. Хроматиновые структуры содержат следующие компоненты:

• ДНК (в форме дезоксирибонуклеопротеида);
• гистоновые белки;
• нсгистоновыс белки (регуляторные, рецепторные белки и др.);
• ферменты (ДНК-полимераза, РНК-полимераза и др.);
• и PH К, тРНК;
• прочие (минеральные компоненты, липиды и др.).

Молекулярная организация. Хроматиновые структуры представляют собой линейные полимерные образования, состоящие из множества однотипных структурных единиц - нуклеосом. Основу (сердцевину, или кор) нуклеосомы составляет образование, состоящее из восьми молекул гистоновых белков, на которое намотаны в виде левозакручеииой суперспирали 1,75 витка ДНК общей длиной 145 нуклеотидных пар (рис. 3.31). При этом молекулы гистонов взаимодействуют с молекулой ДНК таким образом, что положительно заряженные радикалы входящих в их состав аминокислотных осгаткон нейтрализуют отрицательно заряженные фосфатные группы остова ДНК. Этим обстоятельством объясняется столь компактная упаковка хроматиновых структур в ядре (длина ДНК человека составляет 1,7-2 м, а диаметр клеточного ядра - не более 5-7 мкм).

Молекула ДНК непрерывна и переходит с одной нуклеосомы на другую, соединяя их в линейную структуру - нуклеосомную нить. Участок ДНК между нуклеосомами называется линкерной ДНК; ее протяженность составляет 10-100 нуклеотидных пар. Молекула ДНК не имеет свободных концов. В конечных участках плечей хромосом (теломерах - см. ниже) она образует петлю, фиксированную специальными (теломерными) белками (рис. 3.32), благодаря чему молекула ДНК оказывается защищенной от соединения с концами других молекул ДНК (или двунитевыми разрывами) и от разрушающего действия ферментов.

Рис. 331. Рис. 3.32. Петля ДНК, фиксированная

1 - ДНК; Н2А, Н2В, НЗ, Н4 - специальными белками в области гистоновые белки теломеры (теломерные белки

представлены в виде объемных тонированных фигур)

Ядерный аппарат клетки состоит из поверхностного аппарата ядра, кариоплазмы, ядерного матрикса и хроматина. Основными его функциями являются: хранение, воспроизведение, реализация и восстановление (репарация) генетической информации.

Поверхностный аппарат ядра состоит из ядерной оболочки, поровых комплексов и периферической плотной пластины, или ламины.

Ядерная оболочка состоит из двух мембран - наружной и внутренней, между которыми находится перинуклеарное пространство. В некоторых участках мембраны сливаются и образуют поры диаметром до 100 нм. Обе мембраны имеют жидкостно-мозаичное строение. Перинуклеарное пространство сообщается с полостью шероховатой эндоплазматической сети.

Основная функция ядерной оболочки - создание отдельного компартмента клетки для хранения и реализации генетической информации. Через ядерную оболочку происходит регуляция концентрации ионов кальция в клетке.

Поровые комплексы построены из белков, создающих три кольца цитоплазматическое, ядерное и внутреннее, каждое из которых состоит из восьми белковых субъединиц. Белковые кольца расположены в наружней и внутренней мембранах. От цитоплазматического, ядерного и внутреннего колец во внутрь порового комплекса могут отходить белковые фибриллы. Фибриллы образуют ловчие сети, которые обеспечивают избирательную проницаемость ядерной поры.

Поровые комплексы транспортируют определенные биополимеры из ядра в цитоплазму и обратно. Ионы, мелкие и средние органические моле кулы и олигомеры могут относительно свободно диффундировать через поровые комплексы. Из ядра в цитоплазму транспортируются все виды РНК и субъединицы рибосом. В ядро из гиалоплазмы транспортируются так называемые нуклеофильные белки. Небольшие белки, например, гистоны, могут свободно проникать в ядро.

Периферическая плотная пластина (ППП) состоит из белков-ламинов А, В, и С, которые взаимодействуют между собой, образуя сетчатую или ортогональную структуру. ППП является основным компонентом кариоскелета, определяющим форму ядра. Ламины взаимодействуют со скелетными фибриллами, обеспечивая взаимосвязь с цитоскелетом. Кроме того, они поддерживают структуры поровых комплексов и принимают участие в пространственной организации хроматина.

Кариоплазма. Это внутренняя среда ядра, представляющая собой водный раствор органических веществ и ионов. Кариоплазма необходима для протекания матричных процессов, в ней располагаются ядерный матрикс и хроматин.

Ядерный матрикс. Он состоит из двух частей: периферической и внутренней. К периферической части относят ламину, а внутренняя часть включает интерхроматиновую и ядрышковую сети. В ее состав входят различные белки, в том числе актиновые микрофиламенты, скелетные фибриллы и коллаген. Ядрышковая сеть обеспечивает пространственную организацию хроматина и участвует в образовании ядрышка.

Ядрышки - обязательный компонент ядра, обнаруживаются в интерфазных ядрах и представляют собой мелкие тельца, шаровидной формы. Ядрышки имеют большую плотность, чем ядро. В ядрышках происходит синтез р–РНК, других видов РНК и образование субъединиц рибосом. Возникновение ядрышек связано с определенными зонами хромосом, называемыми ядрышковыми организаторами. Число ядрышек определяется числом ядрышковых организаторов. В них содержатся гены р–РНК.

Хроматин (окрашенный материал) – плотное вещество ядра, хорошо окрашиваемое основными красителями. В состав хроматина входят молекулы ДНК в комплексе с белками (гистонами и негистонами), РНК.